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黄曲霉毒素总量(Aflatoxin Total)ELISA检测试剂盒说明书
【概要】
黄曲霉毒素是一类真菌（主要是黄曲霉和寄生曲霉）代谢的有毒产物，主要存在于谷物，坚果，棉籽以及一些与人类血液，动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2这四种毒素为主，黄曲霉毒素总量一般是指这四种毒素的总量。它们是I类致癌物，被证明对人和动物的肝脏、肾脏等组织和器官具有很大的危害，是一类毒性很强的致癌物质。因此，必须对其进行及时检测监控，目前主要的检测手段是高效液相色谱法。（HPLC）
本产品是基于免疫竞争法检测原理建立的一种快速定量检测黄曲霉总量的试剂盒。它具有简单、快速，无需特殊仪器设备等优势，既可以用于实验室检测，也可在农场、饲料混合车间等进行实地测定。
【适用范围】
可定性、定量检测玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素总量。
【试验原理】
本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本/黄曲霉毒素总量标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素总量抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素总量抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去，再加入TMB显色液，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素总量的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物黄曲霉毒素总量的含量。
【试剂盒灵敏度】
试剂盒灵敏度：0.1ppb
【交叉反应率】
结构类似物 交叉反应率
黄曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黄曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 75%
黄曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 100%
黄曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 97%
黄曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 30%
【试剂盒组成】
1. 96孔板×1块
2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶标物1瓶 ………………………………………… 6ml
4. 显色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 终止液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 浓缩洗涤液 （10×）1瓶………………………… 50ml
7. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶 ……………………50ml
8. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶 ……………………25ml
【需要而未提供的设备及试剂】
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅振荡器
┅┅氮吹仪
┅┅粉碎机
┅┅离心机
┅┅微量天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：单道 20μl～200μl、200μl～1000μl、 多道300μl
试剂：
┅┅甲醇（分析纯）
┅┅石油醚
┅┅去离子水（或蒸馏水）
┅┅乙腈
┅┅NaCl
【试剂配制】
1. 样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩样品稀释液+9份去离子水）。
2. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。
3. 谷物稀释液：将0.9gNaCl用配制完成的样品稀释液溶解并定容至100ml。
4. 啤酒稀释液：取无水甲醇，用配制完成的样品稀释液按1:4体积比进行稀释（1份甲醇+4份样品稀释液）。
5. 50%甲醇：取无水甲醇，用去离子水按1:1体积比进行稀释（1份无水甲醇+1份去离子水）。
【样本前处理步骤】
一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀释倍数：8）
1. 取1.0g粉碎的样品与8ml 谷物稀释液混合均匀；
2. 强力振荡3min；
3. 5000g离心10min；
4. 取上清液100μl待测。
二、 蛋糕（稀释倍数：10）
1. 取1.0g粉碎的样品与4ml 50%甲醇混合均匀；
2. 强力振荡3min；
3. 5000g离心10min；
4. 取400μl下层液体，加入600μl样品稀释液进行稀释，充分混匀；
5. 取100μl稀释后液体待测。
三、 花生、奶油蛋糕（稀释倍数：10）
1. 取1.0g粉碎的样品与4.0ml石油醚混合均匀；
2. 加入4ml 50%甲醇混合均匀；
3. 强力振荡3min；
4. 5000g离心10min；
5. 取400μl下层液体，加入600μl样品稀释液进行稀释，充分混匀；
6. 取100μl稀释后液体待测。
四、 食用油（稀释倍数：10）
1. 取1.0g样品与4.0ml石油醚混合均匀；
2. 加入4ml 50%甲醇混合，振荡1min；
3. 静置10min；
4. 取400μl下层液体，加入600μl样品稀释液进行稀释，充分混匀；
5. 取100μl稀释后液体待测。
五、 饲料、面粉、汤圆（稀释倍数：24）
1. 取3.0g粉碎的样品与9.0ml 80%甲醇混合均匀；
2. 强力振荡3min；
3. 2000g离心10min；
4. 取上层清液100μl，加入700μl样品稀释液，混合均匀；
5. 取100μl稀释后液体待测。
六、 啤酒（稀释倍数：5）
1. 取200μl啤酒样品（去除CO2），加入800μl啤酒稀释液；
2. 振荡3min；
3. 取100μl稀释后液体待测。
七、酱油、醋、葡萄酒（稀释倍数：8）
1. 取0.5ml样品，加入0.5ml蒸馏水并加入4.0ml三氯甲烷；
2. 混匀振荡3min，5000g离心10min；
3. 取1.0ml下层液，60℃氮气吹干；
4. 加入100μl乙腈溶解干燥物，并加入900μl样品稀释液，充分混匀；
5. 取100μl稀释后液体待测。
【检测步骤】
一、 测定前须知：
1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。
2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃，干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。
3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。
4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
二、操作步骤：
1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。
2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷冻。
3. 洗涤工作液在使用前也需回温。
4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5. 加标准品/样本50μl到对应的微孔中，加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。
6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300μl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。
7. 加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。
8. 加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。
【结果判定】
1. 百分吸光率的计算
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
2. 标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，黄曲霉毒素总量标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素总量实际量。
【注意事项】
1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3. 每种试剂使用前均需摇匀。
4. 反应终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。
5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6. 储存条件：
试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。
7. 试剂变质的迹象：
显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。反之，则减短反应时间。
9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【样品最低检测限】
谷物 ………………………………………………0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………1ppb
花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb
食用油 ………………………………………………1ppb
饲料、面粉、汤圆………………………………2.4ppb
啤酒 ………………………………………………0.5ppb
酱油、醋 …………………………………………0.8ppb
【贮藏条件及保存期】
贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。
