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呕吐毒素（DON）ELISA检测试剂盒说明书
【概要】
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素(vomitoxin)，主要是由镰刀菌的某些产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物——单端孢霉烯族化合物中的一种。DON 的主要产生菌是禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关。DON属于剧毒或中等毒物，人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国谷物中DON 的限量标准为1．0 mg／kg 。因此，有必要对其进行有效的监控。HPLC或GC-MS用作检测呕吐毒素的方法，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。酶联免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测呕吐毒素。
【适用范围】
本试剂盒可定性、定量测定大米、小米、小麦等谷物及饲料中的呕吐毒素。
【试验原理】
本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被呕吐毒素抗原，加入样本/呕吐毒素标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的呕吐毒素抗体。样本或标准品溶液中的呕吐毒素与预包被在板孔上的呕吐毒素抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的呕吐毒素抗体，未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物呕吐毒素抗原的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物呕吐毒素的含量。
【试剂盒灵敏度】
试剂盒灵敏度：3ppb
【交叉反应率】
结构类似物 交叉反应率
脱氧雪腐镰刀菌烯醇 …………………………………………………… 100%
3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 ……………………………………… 15%
15-O-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 …………………………………… 11%
【试剂盒组成】
1. 96孔板×1块
2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 36ppb,72ppb
3. 酶标物1瓶 …………………………………………… 7ml
4. 显色液1瓶 ……………………………………………12ml
5. 终止液1瓶 ……………………………………………10ml
6. 浓缩洗涤液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml
7. 浓缩样品稀释液（20×）1瓶……………………… 40ml
【需要而未提供的设备】
----微孔板酶标仪450nm/630nm
----振荡器
----离心机
----粉碎机
----天平：感量0.01g
----微量移液器：单道 20ul～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
【试剂配制】
1. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。
2. 样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:19体积比进行稀释（1份浓缩样品提取液+19份去离子水）。
【样本前处理步骤】
一、大米、小米、面粉等谷物及饲料Ⅰ（稀释倍数：50）
1. 取0.1g粉碎好的样品，加入5ml样品稀释液，混匀；
2. 充分振荡10min；
3. 4000g室温离心10min；
4. 取100μl上清液体待测。
二、大米、小米、面粉等谷物及饲料Ⅱ（稀释倍数：50）
1. 取20g粉碎好的样品，加入100ml水，混匀；
2. 充分振荡10min；
3. 4000g室温离心10min或定性滤纸过滤；
4. 取50μl上清液体，加入450μl样品稀释液，混匀；
5. 取100μl上清液体待测。
【检测步骤】
一、 测定前须知：
1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。
2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃，干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。
3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。
4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
二、操作步骤：
1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。
2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷冻。
3. 洗涤工作液在使用前也需回温。
4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5. 加标准品/样本50μl到对应的微孔中，加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。
6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300μl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。
7. 加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。
8. 加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。
【结果判定】
1. 百分吸光率的计算
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
2. 标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，呕吐毒素标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素实际含量。
【注意事项】
1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3. 每种试剂使用前均需摇匀。
4. 反应终止液为2M盐酸，避免接触皮肤。
5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6. 储存条件：
试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。
7. 试剂变质的迹象：
显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。反之，则减短反应时间。
9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【试剂盒灵敏度】
试剂盒灵敏度：3ppb
【样品最低检测限】
谷物、饲料…………………………………………150ppb
【贮藏条件及保存期】
贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。
